ATF4 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-419228-ACT

Il gene Atf4 del topo codifica per l’Activating Transcription Factor 4 (ATF4), un fattore di trascrizione bZIP sensibile allo stress che integra i segnali provenienti dalla risposta integrata allo stress (ISR) e dalla risposta alle proteine non correttamente ripiegate (UPR) per rimodellare i programmi di espressione genica. ATF4 viene indotto a valle della fosforilazione di eIF2α e coordina il metabolismo degli amminoacidi, l’omeostasi redox e del glutatione, l’autofagia e le vie di sopravvivenza adattativa durante limitazione di nutrienti, stress del reticolo endoplasmatico e ipossia. Attraverso un crosstalk con le vie di segnalazione PERK–eIF2α, mTOR e dello stress ossidativo, ATF4 influenza la differenziazione cellulare e la funzione mitocondriale in molteplici tessuti. Un’attività deregolata di ATF4 è stata associata ad adattamenti patologici allo stress e a fenotipi infiammatori e metabolici, rendendolo un nodo utile per studi meccanicistici della proteostasi e per modelli murini di malattie legate allo stress.

ATF4 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Atf4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ATF4 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Atf4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Atf4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ATF4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Atf4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ATF4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ATF4 nelle cellule tumorali con espressione di Atf4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.