Plasmide CRISPR d'Activation (h) AGA: sc-409587-ACT

L’AGA humain code l’aspartylglucosaminidase, une hydrolase lysosomale qui clive la liaison GlcNAc–asparagine liée en N au cours du catabolisme des glycoprotéines. Cette activité soutient le renouvellement des protéines dans le lysosome et, plus largement, la protéostasie cellulaire, en s’articulant avec la fonction autophagie–lysosome et les voies de trafic endosomal. La perte de la fonction enzymatique d’AGA perturbe la dégradation des glycoasparagines, entraînant une accumulation de substrats lysosomaux et des réponses de stress cellulaire en aval. AGA est impliquée dans la physiopathologie moléculaire de l’aspartylglucosaminurie, ce qui en fait une cible pertinente pour l’étude de la biologie des maladies de surcharge lysosomale et des mécanismes de dégradation des glycoprotéines.

AGA Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de AGA sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

AGA Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus AGA dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription AGA, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de AGA. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus AGA natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de AGA au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie AGA dans les cellules tumorales présentant une expression de AGA silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.