Adenylate cyclase 8/AC8/ADCY8 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402004-ACT

L’ADCY8 umano codifica l’adenilato ciclasi 8 (AC8), un’adenilil ciclasi di membrana stimolata da calcio/calmodulina che catalizza la conversione dell’ATP in cAMP, un secondo messaggero centrale che controlla PKA, EPAC e la segnalazione mediata da canali regolati da nucleotidi ciclici. Accoppiando la dinamica intracellulare del Ca2+ alla produzione di cAMP, AC8 modella risposte dipendenti da GPCR e dall’attività che regolano l’eccitabilità neuronale, la plasticità sinaptica e i processi di stimolo-secrezione. L’attività di ADCY8 si integra con programmi trascrizionali dipendenti da CREB e con il feedback esercitato dalle fosfodiesterasi per modulare ampiezza e durata del segnale. Studi genetici e funzionali implicano la disregolazione del cAMP legata ad ADCY8 in fenotipi neuropsichiatrici e cognitivi, sostenendo ricerche meccanicistiche su apprendimento, memoria e segnalazione a livello di circuiti.

Adenylate cyclase 8/AC8/ADCY8 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ADCY8 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Adenylate cyclase 8/AC8/ADCY8 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ADCY8 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ADCY8, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Adenylate cyclase 8/AC8/ADCY8. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ADCY8 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Adenylate cyclase 8/AC8/ADCY8 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Adenylate cyclase 8/AC8/ADCY8 nelle cellule tumorali con espressione di ADCY8 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.