α-KGD Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402915-ACT

OGDH codifica o componente E1 do complexo mitocondrial 2-oxoglutarato desidrogenase (α-KGD), uma enzima limitante da velocidade no ciclo do ácido tricarboxílico (TCA) que converte α-cetoglutarato em succinil-CoA, ao mesmo tempo em que gera NADH para a fosforilação oxidativa. Ao controlar o fluxo de α-cetoglutarato, a OGDH conecta o metabolismo central do carbono ao catabolismo de aminoácidos, ao equilíbrio redox e ao manejo de espécies reativas de oxigênio mitocondriais. Alterações na atividade de OGDH podem modificar os níveis de α-cetoglutarato e de metabólitos relacionados que influenciam a regulação epigenética por meio de dioxigenases, ligando o metabolismo mitocondrial ao estado da cromatina. A desregulação desse ponto de controle tem sido associada à disfunção metabólica mitocondrial e foi estudada em contextos como neurodegeneração e metabolismo do câncer.

α-KGD O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de OGDH sem alterar a sequência de ADN subjacente.

α-KGD O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus OGDH em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição OGDH, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de α-KGD. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus OGDH nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de α-KGD no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via α-KGD em células tumorais com expressão de OGDH silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.