VAMP-1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401607-ACT

VAMP1 codifica la proteina 1 associata alla membrana delle vescicole (VAMP-1), una SNARE della famiglia delle sinaptobrevine che media l’ancoraggio delle vescicole sinaptiche e la fusione di membrana necessari per il rilascio di neurotrasmettitori innescato dal Ca2+. VAMP-1 partecipa alle principali vie presinaptiche dell’esocitosi attraverso la formazione di complessi SNARE con le sintassine e SNAP-25, sostenendo un rapido riciclo delle vescicole e la trasmissione sinaptica. L’alterazione della fusione vescicolare dipendente da VAMP1 perturba la comunicazione neuronale ed è stata collegata a fenotipi neurosviluppativi e neuromuscolari, rendendola rilevante per lo studio della disfunzione sinaptica. Nei modelli cellulari umani, la regolazione di VAMP1 è utile anche per analizzare la dinamica del traffico di membrana e la secrezione dipendente dall’attività.

VAMP-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di VAMP1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

VAMP-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus VAMP1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione VAMP1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di VAMP-1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus VAMP1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da VAMP-1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via VAMP-1 nelle cellule tumorali con espressione di VAMP1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.