Plasmide CRISPR d'Activation (h) Unc18-2: sc-403691-ACT

STXBP2 code la protéine 2 liant la syntaxine (Unc18-2), un régulateur de la famille Sec1/Munc18 de l’assemblage du complexe SNARE, indispensable à l’amarrage des vésicules et à la fusion membranaire. Dans les cellules immunitaires, Unc18-2 soutient l’exocytose des granules cytotoxiques et la sécrétion régulée, en s’intégrant à des voies qui contrôlent la dégranulation, le trafic endolysosomal et le remodelage membranaire. Une altération de la fonction de STXBP2 a été associée à des phénotypes de dérégulation immunitaire, ce qui en fait une cible pertinente pour étudier les défauts de sécrétion médiée par des vésicules et les programmes de signalisation inflammatoire en aval. Son activité est également informative dans des contextes plus larges du contrôle des voies sécrétoires, notamment le recyclage des récepteurs et la communication cellule-cellule.

Unc18-2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de STXBP2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Unc18-2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus STXBP2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription STXBP2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Unc18-2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus STXBP2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Unc18-2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Unc18-2 dans les cellules tumorales présentant une expression de STXBP2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.