Twinkle CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404159-ACT

Das humane Gen **TWNK** kodiert **Twinkle**, eine in den Mitochondrien lokalisierte DNA-Helikase, die für die Replikation und Aufrechterhaltung der mtDNA essenziell ist. Twinkle wirkt zusammen mit **POLG** und dem mitochondrialen **SSB**, um doppelsträngige mtDNA während der Progression des Replisoms zu entwindet, und unterstützt damit die mitochondriale Genexpression sowie die Kapazität der oxidativen Phosphorylierung. Eine Störung von **TWNK** beeinflusst Kopienzahl und Integrität der mtDNA und verknüpft eine Twinkle-Dysfunktion mit Instabilität des mitochondrialen Genoms, veränderter Bioenergetik und zellulären Stressantworten. Diese Prozesse sind relevant für Studien zu neuromuskulären und metabolischen Phänotypen, die durch eine beeinträchtigte Aufrechterhaltung der mitochondrialen DNA bedingt sind.

Twinkle Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TWNK-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Twinkle Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TWNK-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TWNK-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Twinkle-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TWNK-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Twinkle-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Twinkle-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TWNK-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.