TTP-α Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-411045-ACT

TTPA codifica la proteina di trasferimento dell’α‑tocoferolo (TTP‑α), una proteina citosolica legante lipidi che trasporta selettivamente l’α‑tocoferolo (vitamina E) per sostenere le difese antiossidanti cellulari e l’integrità delle membrane. Regolando la distribuzione intracellulare della vitamina E, TTP‑α influenza l’omeostasi redox, la suscettibilità alla perossidazione lipidica e la segnalazione sensibile allo stress associata alla funzione mitocondriale e del reticolo endoplasmatico. Un’attività alterata di TTPA è associata a fenotipi neurodegenerativi e a una vulnerabilità tissutale legata allo stress ossidativo, a testimonianza dell’importanza della gestione dell’α‑tocoferolo nelle cellule longeve e metabolicamente attive. La regolazione di TTPA nell’uomo è pertanto rilevante per studi sul metabolismo lipidico, sul danno ossidativo e sulle relazioni genotipo–fenotipo in modelli neuronali ed epatici.

TTP-α Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TTPA senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

TTP-α Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TTPA nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TTPA, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di TTP-α. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TTPA nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da TTP-α nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via TTP-α nelle cellule tumorali con espressione di TTPA silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.