Topo IIβ Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400773-ACT

TOP2B codifica la DNA topoisomerasi IIβ (Topo IIβ) umana, un enzima ATP-dipendente che risolve il superavvolgimento e la catenazione del DNA creando rotture transitorie a doppio filamento e religando il DNA durante la trascrizione e il rimodellamento della cromatina. Topo IIβ supporta l’organizzazione del genoma e la regolazione genica a lunga distanza, contribuendo a programmi trascrizionali dipendenti dalla RNA polimerasi II e al mantenimento della stabilità genomica. La sua attività si interseca con la segnalazione della risposta al danno al DNA, con il controllo topologico legato al ciclo cellulare e con switch trascrizionali associati alla differenziazione. Una funzione o un’espressione deregolata di TOP2B è stata associata ad alterazioni del panorama trascrizionale, a fenotipi di instabilità genomica e a risposte allo stress rilevanti per la malattia, studiate in biologia del cancro, neurobiologia e nei meccanismi di cardiotossicità.

Topo IIβ Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TOP2B senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Topo IIβ Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TOP2B nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TOP2B, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Topo IIβ. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TOP2B nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Topo IIβ nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Topo IIβ nelle cellule tumorali con espressione di TOP2B silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.