TFIIIC110 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404261-ACT

GTF3C2 codifica TFIIIC110, una subunità centrale del complesso TFIIIC che riconosce elementi promotori interni e supporta la trascrizione, da parte dell’RNA polimerasi III, di tRNA, rRNA 5S e altri piccoli RNA non codificanti. Coordinando l’assemblaggio di TFIIIC e il suo accoppiamento funzionale con il reclutamento di TFIIIB, TFIIIC110 contribuisce alla proteostasi, alla capacità di traduzione e ai programmi di adattamento allo stress cellulare che dipendono dall’output di Pol III. I componenti di TFIIIC partecipano anche all’organizzazione della cromatina e all’architettura del genoma tramite il legame ai loci dei geni dei tRNA e a siti regolatori correlati. Alterazioni del controllo trascrizionale di Pol III e la disregolazione delle subunità di TFIIIC sono state associate a segnali proliferativi e a stati oncogenici, incentivando studi meccanicistici su GTF3C2 nell’omeostasi trascrizionale e nella regolazione genica rilevante per la malattia.

TFIIIC110 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di GTF3C2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

TFIIIC110 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus GTF3C2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione GTF3C2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di TFIIIC110. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus GTF3C2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da TFIIIC110 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via TFIIIC110 nelle cellule tumorali con espressione di GTF3C2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.