TFEB Particelle di Attivazione Lentivirale (h): sc-401388-LAC

Il fattore di trascrizione EB (TFEB) è un regolatore principale della biogenesi lisosomiale e dell’autofagia, coordinando l’espressione della rete CLEAR per mantenere la proteostasi e l’adattamento cellulare allo stress nutritivo e ossidativo. L’attività di TFEB è strettamente controllata da vie di rilevamento dei nutrienti, inclusa la fosforilazione dipendente da mTORC1 e la ritenzione citoplasmatica; in condizioni di stress, la traslocazione nel nucleo attiva programmi genici lisosoma–autofagia. Attraverso la regolazione del traffico endolisosomiale, del catabolismo lipidico e del controllo di qualità mitocondriale, TFEB influenza la segnalazione infiammatoria e l’omeostasi metabolica in diversi tipi cellulari. Una segnalazione di TFEB deregolata è stata implicata nelle malattie da accumulo lisosomiale, in modelli di malattie neurodegenerative, nell’adattamento delle cellule tumorali e nella disfunzione cardiometabolica, rendendolo un nodo utile per l’interrogazione delle vie di segnalazione nei sistemi umani.

Le particelle di attivazione lentivirale TFEB (h) rispondono a questa esigenza incapsulando il sistema completo di attivazione trascrizionale del mediatore di attivazione sinergica (SAM) in particelle lentivirali ad alto titolo pronte per la trasduzione, consentendo un'efficiente sovraregolazione di TFEB in una gamma più ampia di tipi di cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale TFEB (h) veicolano tutti i componenti funzionali del sistema del mediatore di attivazione sinergica (SAM) tramite trasduzione lentivirale. Il sistema comprende tre preparati di particelle co-trasdotti nelle cellule bersaglio: uno che codifica per dCas9 cataliticamente inattivo (mutazioni D10A e N863A) fuso al dominio di transattivazione VP64 con un gene di resistenza alla blasticidina; una che codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 con un gene di resistenza all'igromicina; e una che codifica un sgRNA di 20 nt specifico per il bersaglio fuso a due aptameri di RNA MS2 con un gene di resistenza alla puromicina. A seguito della trasduzione lentivirale e dell'integrazione genomica dei cassetti di espressione, i componenti del SAM vengono espressi in modo stabile e si assemblano nel locus bersaglio all'interno della regione promotrice prossimale a monte del sito di inizio della trascrizione TFEB, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo cooperativo per reclutare il machinery trascrizionale endogeno e guidare una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endogena di TFEB. L'uso di dCas9 inattivo nei confronti delle nucleasi evita l'introduzione di rotture del DNA a doppio filamento e preserva il locus genomico nativo TFEB e l'architettura regolatoria.

Il formato lentivirale offre diversi vantaggi pratici: l'integrazione genomica stabile supporta l'attivazione ereditaria attraverso le divisioni cellulari; le preparazioni di particelle ad alto titolo eliminano la necessità di una produzione virale interna; e la compatibilità con tipi di cellule primarie, non in divisione e resistenti alla trasfezione amplia l'accessibilità sperimentale. Il successo della trasduzione può essere confermato e potenziato attraverso una selezione antibiotica tripla utilizzando puromicina, igromicina e blasticidina.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.