Telethonin Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402317-ACT

TCAP codifica la telethonina, una proteina sarcomerica del disco Z che si lega all’estremità N-terminale della titina (TTN) e contribuisce a stabilizzare l’assemblaggio delle miofibrille e l’accoppiamento meccanico nel muscolo striato. La telethonina partecipa al mantenimento dell’integrità del sarcomero e alla segnalazione associata alla meccanotrasduzione, coordinando l’organizzazione dei complessi proteici al disco Z durante lo sviluppo e l’adattamento muscolare. Alterazioni dell’espressione di TCAP o della funzione della telethonina sono state associate a cardiomiopatie ereditarie e a patologie del muscolo scheletrico, a testimonianza della sensibilità dell’architettura contrattile alla stechiometria delle proteine del disco Z. In quanto nodo in complessi centrati sulla titina, la telethonina è spesso studiata in vie che regolano l’organizzazione del citoscheletro, il mantenimento delle fibre muscolari e il rimodellamento responsivo allo stress.

Telethonin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TCAP senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Telethonin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TCAP nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TCAP, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Telethonin. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TCAP nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Telethonin nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Telethonin nelle cellule tumorali con espressione di TCAP silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.