TEL Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402207-ACT

ETV6 (TEL) è un repressore trascrizionale della famiglia ETS essenziale per l’omeostasi delle cellule staminali e progenitrici ematopoietiche, per l’impegno di linea e per il mantenimento della stabilità genomica. Attraverso il suo dominio di oligomerizzazione PNT e il dominio ETS di legame al DNA, TEL coordina programmi trascrizionali che modellano il controllo del ciclo cellulare, la differenziazione e le vie di sopravvivenza, inclusa la regolazione di reti di segnalazione responsivi alle citochine. L’alterazione della funzione di ETV6 è fortemente associata alla biologia delle malattie ematologiche, in particolare tramite fusioni geniche ricorrenti e lesioni con perdita di funzione che modificano la regolazione trascrizionale e lo stato della cromatina. Queste caratteristiche rendono TEL un nodo ampiamente studiato per investigare il riassetto trascrizionale oncogenico, l’evoluzione clonale e i meccanismi dello sviluppo delle cellule del sangue.

TEL Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ETV6 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

TEL Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ETV6 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ETV6, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di TEL. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ETV6 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da TEL nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via TEL nelle cellule tumorali con espressione di ETV6 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.