TBC1D7 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403595-ACT

TBC1D7 kodiert ein kleines Protein mit TBC-Domäne, das als zentraler Bestandteil des TSC1–TSC2–TBC1D7-Komplexes fungiert, einem wichtigen negativen Regulator der mTORC1-Signalübertragung. Durch die Stabilisierung des TSC-Komplexes und die Unterstützung der GAP-Aktivität gegenüber RHEB trägt TBC1D7 dazu bei, Wachstumsfaktor- und Nährstoffsignale mit der Kontrolle von Proteinsynthese, Autophagie und Zellstoffwechsel zu verknüpfen. Eine veränderte Dosierung oder Funktion von TBC1D7 wurde mit einer fehlregulierten Aktivität des mTOR-Signalwegs und mit Phänotypen in Verbindung gebracht, die mit einer Beeinträchtigung des Tumorsuppressor-Netzwerks vereinbar sind. Daher wird TBC1D7 häufig in Kontexten wie der Kontrolle des Zellwachstums, Stressantworten und Signalweg-Crosstalk untersucht, der Proliferation und Differenzierung beeinflusst.

TBC1D7 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TBC1D7-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

TBC1D7 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TBC1D7-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TBC1D7-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen TBC1D7-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TBC1D7-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von TBC1D7-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des TBC1D7-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TBC1D7-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.