Syntaxin 8 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-405269-ACT

STX8 kodiert Syntaxin 8, ein Q-SNARE-Protein, das das Andocken von Vesikeln und die Membranfusion innerhalb des endosomalen Systems koordiniert. Syntaxin 8 ist über die Assemblierung von SNARE-Komplexen an Transportwegen vom Endosom zum Trans-Golgi-Netzwerk sowie am endolysosomalen Traffic beteiligt und prägt damit Rezeptorrecycling, Sortierung von Fracht und den auf Lysosomen gerichteten Abbau. Durch die Regulation von Verteilung und Umsatz von Signalrezeptoren und Transportern beeinflusst STX8 die zelluläre Homöostase, Immun-Signalgebung und Stressantworten, die mit vesikulärem Transport verknüpft sind. Eine Fehlregulation des endosomalen Traffickings und der SNARE-Funktion wird häufig mit Neurodegeneration, Anpassungsmechanismen von Krebszellen und der Biologie von Infektionskrankheiten in Verbindung gebracht, wodurch STX8 ein nützlicher Knotenpunkt für pfadorientierte Studien der Membrandynamik ist.

Syntaxin 8 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen STX8-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Syntaxin 8 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des STX8-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der STX8-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Syntaxin 8-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native STX8-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Syntaxin 8-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Syntaxin 8-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem STX8-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.