Synaptotagmin VII Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404291-ACT

SYT7 codifica la sinaptotagmina VII, una proteina di membrana sensibile al Ca2+ che regola l’esocitosi Ca2+-dipendente e la riparazione della membrana attraverso la fusione delle vescicole mediata da SNARE. Partecipa all’esocitosi dei lisosomi secretori, alla risigillatura della membrana plasmatica dopo una lesione e al rilascio regolato di carichi in cellule immunitarie e simil-neuronali, collegando la segnalazione del calcio al traffico vescicolare. L’attività della sinaptotagmina VII influenza processi quali la dinamica del rilascio di neurotrasmettitori, la secrezione di citochine e il traffico endosomiale/lisosomiale. Un’espressione o una funzione alterata di SYT7 è stata associata a fenotipi di secrezione e di omeostasi di membrana disregolate, rilevanti per la neurobiologia, l’infiammazione e le risposte cellulari allo stress.

Synaptotagmin VII Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SYT7 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Synaptotagmin VII Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SYT7 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SYT7, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Synaptotagmin VII. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SYT7 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Synaptotagmin VII nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Synaptotagmin VII nelle cellule tumorali con espressione di SYT7 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.