Synaptotagmin IV Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403314-ACT

SYT4 codifica la sinaptotagmina IV, una proteina di membrana con dominio C2 che si localizza alle vescicole secretorie e modula l’esocitosi Ca²⁺-dipendente nei neuroni e in altre cellule eccitabili. A differenza delle sinaptotagmine canoniche che agiscono da rapidi sensori del Ca²⁺, la sinaptotagmina IV è spesso associata alla regolazione dipendente dall’attività della probabilità di fusione delle vescicole, alla plasticità sinaptica e al rilascio regolato di neuropeptidi e neurotrasmettitori. La funzione di SYT4 si interseca con la fusione di membrana mediata dagli SNARE, il traffico vescicolare e le vie di accoppiamento stimolo-secrezione che influenzano l’adattamento delle reti neuronali. Un’alterata espressione o regolazione dei meccanismi di rilascio vescicolare, inclusa SYT4, è stata associata a fenotipi neuroevolutivi e neuropsichiatrici ed è studiata nel contesto della disfunzione sinaptica.

Synaptotagmin IV Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SYT4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Synaptotagmin IV Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SYT4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SYT4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Synaptotagmin IV. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SYT4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Synaptotagmin IV nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Synaptotagmin IV nelle cellule tumorali con espressione di SYT4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.