SPAG4 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404154-ACT

SPAG4 (antigene 4 associato agli spermatozoi), noto anche come SUN4, è una proteina dell’involucro nucleare arricchita nel testicolo, implicata nell’accoppiamento mediato dal complesso LINC tra nucleo e citoscheletro. Nelle cellule germinali, SPAG4 contribuisce al modellamento del nucleo degli spermatidi e all’organizzazione del citoscheletro durante la spermiogenesi, riflettendo ruoli nel posizionamento nucleare e nella meccanotrasduzione alla periferia del nucleo. L’alterazione o la deregolazione dell’espressione di SPAG4 è stata associata a fenotipi di fertilità maschile ed è stata anche riportata come espressa in modo aberrante in molteplici contesti tumorali, dove viene studiata come antigene cancro-testis. Queste proprietà rendono SPAG4 un modello utile per lo studio della dinamica dell’involucro nucleare, dei programmi di differenziazione della linea germinale e dell’espressione antigenica deregolata in stati cellulari rilevanti per la malattia.

SPAG4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SPAG4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

SPAG4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SPAG4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SPAG4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di SPAG4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SPAG4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da SPAG4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via SPAG4 nelle cellule tumorali con espressione di SPAG4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.