SLC17A9 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403175-ACT

SLC17A9 codifica un trasportatore vescicolare di nucleotidi (VNUT) che carica ATP e altri nucleotidi nelle vescicole secretorie, consentendo una segnalazione purinergica regolata in risposta agli stimoli. Controllando l’accumulo e il rilascio vescicolare di ATP, SLC17A9 influenza il tono dei nucleotidi extracellulari e le vie a valle mediate dai recettori P2, che modulano la dinamica del calcio, la secrezione, le risposte legate all’inflammasoma e la comunicazione intercellulare. La sua attività è stata studiata in contesti in cui un’alterata segnalazione purinergica contribuisce a una segnalazione infiammatoria aberrante, all’elaborazione del dolore e al rimodellamento del microambiente associato ai tumori. La modulazione dell’espressione di SLC17A9 è quindi rilevante per studi meccanicistici sulla biologia delle vescicole, sulle reti di segnalazione dipendenti dai nucleotidi e sui fenotipi cellulari responsivi allo stress.

SLC17A9 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SLC17A9 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

SLC17A9 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SLC17A9 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SLC17A9, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di SLC17A9. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SLC17A9 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da SLC17A9 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via SLC17A9 nelle cellule tumorali con espressione di SLC17A9 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.