SERCA2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400417-ACT

ATP2A2 codifica la Ca²⁺-ATPasi del reticolo sarco/endoplasmatico umano SERCA2, un’ATPasi di tipo P che pompa il Ca²⁺ citosolico nel lume del RE/RS per mantenere l’omeostasi del calcio e rifornire i depositi intracellulari. Modulando i transienti di Ca²⁺, SERCA2 influenza l’accoppiamento eccitazione–contrazione, la capacità di ripiegamento proteico del RE e le reti di segnalazione calcio-dipendenti coinvolte nelle risposte allo stress e nell’apoptosi. L’attività di SERCA2 è integrata con la regolazione mediata dal fosfolambano e con vie più ampie di trasporto ionico che governano la bioenergetica cellulare e la contrattilità. La deregolazione o le mutazioni di ATP2A2 sono associate a un’alterata gestione del Ca²⁺ nel RE e sono state implicate in disturbi dell’integrità epiteliale e della fisiologia cardiaca, offrendo un punto d’ingresso meccanicistico per studiare fenotipi patologici calcio-dipendenti.

SERCA2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ATP2A2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

SERCA2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ATP2A2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ATP2A2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di SERCA2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ATP2A2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da SERCA2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via SERCA2 nelle cellule tumorali con espressione di ATP2A2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.