secretin receptor Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-435601-ACT

O gene Sctr de camundongo codifica o recetor de secretina, um GPCR de classe B que se liga à secretina para regular a secreção de fluidos ricos em bicarbonato e o transporte epitelial no trato gastrointestinal e no pâncreas. A ativação do recetor envolve principalmente a via de sinalização Gs–adenilil ciclase, elevando o cAMP e ativando programas transcricionais e metabólicos dependentes de PKA, com acoplamento adicional que pode influenciar a sinalização de cálcio em certos tipos celulares. A atividade de Sctr contribui para a comunicação neuroendócrina e eixo intestino–cérebro, moldando a fisiologia digestiva e a homeostase energética. A desregulação da sinalização do recetor de secretina tem sido investigada em modelos de disfunção exócrina pancreática, doenças colestáticas e gastrointestinais e fenótipos neurocomportamentais, tornando o Sctr um nó útil para a análise de vias em vivo e em células em cultura.

secretin receptor O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Sctr sem alterar a sequência de ADN subjacente.

secretin receptor O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Sctr em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Sctr, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de secretin receptor. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Sctr nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de secretin receptor no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via secretin receptor em células tumorais com expressão de Sctr silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.