Sec5 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-405088-ACT

L’EXOC2 umano codifica Sec5, una subunità essenziale del complesso esocisto octamerico, che ancora le vescicole secretorie alla membrana plasmatica per sostenere l’esocitosi polarizzata. Sec5 coordina il targeting delle vescicole con il rimodellamento dell’actina e la segnalazione mediata da piccole GTPasi, contribuendo all’espansione di membrana, alla migrazione cellulare, alla citochinesi e alla consegna regolata di recettori e trasportatori. Attraverso il suo ruolo nel traffico dipendente dall’esocisto, EXOC2 influenza vie che governano la polarità epiteliale e la crescita neuritica, e un’alterata funzione dell’esocisto è stata associata a proliferazione disregolata e fenotipi invasivi in molteplici contesti patologici. I difetti di traffico legati a Sec5 sono quindi rilevanti per studi meccanicistici della dinamica di membrana, della compartimentalizzazione della segnalazione e delle transizioni di stato cellulare.

Sec5 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di EXOC2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Sec5 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus EXOC2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione EXOC2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Sec5. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus EXOC2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Sec5 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Sec5 nelle cellule tumorali con espressione di EXOC2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.