Sar1a CRISPR Activationプラスミド (h): sc-404190-ACT

ヒトSAR1Aは、COPII関連の小型GTPアーゼであるSar1aをコードしており、小胞体（ER）からの輸送小胞の出芽を開始し、ERからゴルジ体への輸送（ER-to-Golgi trafficking）を担います。Sar1aはGDP結合型とGTP結合型の間を循環することで、Sec23/24およびSec13/31からなるコート成分をリクルートし、カーゴ選別、小胞膜の曲率形成、分泌フラックスを制御します。SAR1A依存的な輸送は、ERストレスシグナル伝達や小胞体ストレス応答（UPR：unfolded protein response）を含むプロテオスタシス経路とも交差し、膜タンパク質および分泌タンパク質の細胞内での取り扱いに影響を与えます。分泌経路のダイナミクスやER恒常性の破綻は、細胞外マトリックス沈着の変化、受容体輸送の異常、形質転換細胞におけるストレス適応的なシグナル伝達など、疾患関連の表現型にしばしば関与します。

Sar1a CRISPR活性化プラスミド（h）は、基盤となるDNA配列を変更することなく、内因性SAR1Aの発現を標的化し、非破壊的にアップレギュレートするアプローチを提供します。

Sar1a CRISPR 活性化プラスミド (h) は、ヒト細胞株における SAR1A 遺伝子座の高効率かつ部位特異的な転写アップレギュレーションのために設計された、3 つのプラスミドからなる相乗的活性化メディエーター (SAM) システムです。このシステムは、DNA結合能を維持しつつヌクレアーゼ活性を失わせる2つの不活性化変異（D10AおよびN863A）を有する、触媒活性のないCas9（dCas9）を中核としています。このdCas9は、強力な転写活性化因子であるVP64と融合しており、選別用のブラスティシジン耐性遺伝子と共に共発現します。2番目のプラスミドは、dCas9-VP64と協調して機能する二次活性化複合体であるMS2-p65-HSF1融合タンパク質をコードしており、ヒグロマイシン耐性遺伝子と共に発現する。3番目のプラスミドは、標的特異的な20塩基対のsgRNAをコードしており、これはMS2-p65-HSF1複合体を活性化部位に誘導する2つのMS2 RNAアプタマーと融合しており、さらにピューロマイシン耐性遺伝子が付随している。これら3つのプラスミドは、システム構成要素すべてが均等に発現するよう、質量比1:1:1で導入される。

標的遺伝子座に集合すると、SAM複合体はSAR1A転写開始点の上流約200 bpの領域に結合し、そこでVP64、p65、およびHSF1が協調して転写装置を動員し、内因性Sar1aの発現上昇を促進する。ヌクレアーゼ活性を持つCas9とは異なり、 dCas9は二本鎖切断を導入したりゲノム配列を改変したりしないため、天然のSAR1A遺伝子座が保持され、内因性遺伝子座におけるSar1a依存性の転写応答の研究が可能となります。これにより、機能解析、標的遺伝子の同定、およびSAR1A発現が沈黙または低下した腫瘍細胞におけるSar1a経路の回復のモデル化を行う上で、貴重なツールとなります。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。