SAP 145 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403214-ACT

SF3B2 codifica SAP 145, un componente centrale del sottocomplesso SF3b all’interno della piccola ribonucleoproteina nucleare U2, che promuove l’assemblaggio dello spliceosoma e il riconoscimento accurato del punto di ramificazione durante lo splicing del pre‑mRNA. Coordinando la selezione dei siti di splicing e la definizione degli esoni, SAP 145 sostiene l’integrità del trascrittoma e influenza processi a valle, tra cui la progressione del ciclo cellulare, le risposte al danno al DNA e programmi di espressione genica adattativi allo stress. Una funzione deregolata dei fattori spliceosomiali può spostare l’equilibrio tra isoforme e alterare l’espressione di vie che controllano proliferazione e apoptosi, rendendo SF3B2 un nodo utile per studiare i meccanismi di elaborazione aberrante dell’RNA in contesti rilevanti per la malattia.

SAP 145 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SF3B2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

SAP 145 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SF3B2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SF3B2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di SAP 145. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SF3B2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da SAP 145 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via SAP 145 nelle cellule tumorali con espressione di SF3B2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.