Plásmido CRISPR de Activación (m) RNF4: sc-422689-ACT

El gen murino Rnf4 codifica RNF4, una ligasa E3 de ubiquitina dirigida por SUMO que reconoce sustratos poli-SUMOilados mediante motivos de interacción con SUMO y promueve su ubiquitinación y degradación por el proteasoma. RNF4 ayuda a acoplar la señalización mediada por SUMO al control de calidad proteica dependiente de ubiquitina, influyendo en las respuestas al daño del ADN, el estrés de replicación y la regulación transcripcional mediante la modulación de factores nucleares clave. Al controlar la estabilidad de proteínas modificadas por SUMO, RNF4 contribuye al mantenimiento de la integridad del genoma y a la progresión del ciclo celular, procesos que con frecuencia se ven alterados en la transformación oncogénica. Por ello, la alteración de Rnf4 se utiliza para estudiar el crosstalk entre las vías SUMO–ubiquitina, la proteostasis nuclear y redes de señalización adaptativas al estrés en células de mamífero.

RNF4 El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Rnf4 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

RNF4 El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Rnf4 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Rnf4, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de RNF4. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Rnf4 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de RNF4 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía RNF4 en células tumorales con expresión de Rnf4 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.