RKIP Particelle di Attivazione Lentivirale (h): sc-401270-LAC

Il gene umano PEBP1 codifica la Raf kinase inhibitory protein (RKIP), un modulatore conservato della trasduzione del segnale intracellulare che limita la segnalazione MAPK/ERK interferendo con le interazioni RAF–MEK e influenza inoltre le vie dei GPCR tramite la regolazione di GRK2. RKIP contribuisce all’equilibrio tra proliferazione, differenziamento, apoptosi e risposte allo stress e può modellare il crosstalk tra vie di segnalazione che coinvolgono NF-κB e altri programmi trascrizionali. Un’espressione alterata di RKIP è stata associata a cambiamenti nella motilità cellulare, in fenotipi legati all’invasività e in stati di segnalazione infiammatoria in diversi modelli di malattia. In quanto regolatore nodale della segnalazione, PEBP1 è spesso oggetto di studi sul rimodellamento delle reti di chinasi, sul controllo tramite feedback e su output trascrizionali dipendenti dal contesto.

Le particelle di attivazione lentivirale RKIP (h) rispondono a questa esigenza incapsulando il sistema completo di attivazione trascrizionale del mediatore di attivazione sinergica (SAM) in particelle lentivirali ad alto titolo pronte per la trasduzione, consentendo un'efficiente sovraregolazione di PEBP1 in una gamma più ampia di tipi di cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale RKIP (h) veicolano tutti i componenti funzionali del sistema del mediatore di attivazione sinergica (SAM) tramite trasduzione lentivirale. Il sistema comprende tre preparati di particelle co-trasdotti nelle cellule bersaglio: uno che codifica per dCas9 cataliticamente inattivo (mutazioni D10A e N863A) fuso al dominio di transattivazione VP64 con un gene di resistenza alla blasticidina; una che codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 con un gene di resistenza all'igromicina; e una che codifica un sgRNA di 20 nt specifico per il bersaglio fuso a due aptameri di RNA MS2 con un gene di resistenza alla puromicina. A seguito della trasduzione lentivirale e dell'integrazione genomica dei cassetti di espressione, i componenti del SAM vengono espressi in modo stabile e si assemblano nel locus bersaglio all'interno della regione promotrice prossimale a monte del sito di inizio della trascrizione PEBP1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo cooperativo per reclutare il machinery trascrizionale endogeno e guidare una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endogena di RKIP. L'uso di dCas9 inattivo nei confronti delle nucleasi evita l'introduzione di rotture del DNA a doppio filamento e preserva il locus genomico nativo PEBP1 e l'architettura regolatoria.

Il formato lentivirale offre diversi vantaggi pratici: l'integrazione genomica stabile supporta l'attivazione ereditaria attraverso le divisioni cellulari; le preparazioni di particelle ad alto titolo eliminano la necessità di una produzione virale interna; e la compatibilità con tipi di cellule primarie, non in divisione e resistenti alla trasfezione amplia l'accessibilità sperimentale. Il successo della trasduzione può essere confermato e potenziato attraverso una selezione antibiotica tripla utilizzando puromicina, igromicina e blasticidina.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.