rhodopsin CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401026-ACT

Das humane **RHO**-Gen kodiert Rhodopsin, einen lichtempfindlichen G‑Protein‑gekoppelten Rezeptor, der in die Scheibchen der Außensegmente von Stäbchen-Photorezeptoren eingebettet ist und die Phototransduktionskaskade auslöst. Nach Absorption eines Photons aktiviert Rhodopsin Transducin und moduliert dadurch die cGMP-Signalübertragung, was die Aktivität zyklischer Nukleotid‑gesteuerter Kanäle und die nachgeschaltete Membranhyperpolarisation steuert, die für das Sehen bei schwachem Licht entscheidend ist. Die RHO-Expression und der Proteinumsatz sind eng mit Prozessen der retinalen Homöostase verknüpft, darunter Chromophor-Regeneration im visuellen Zyklus, der Transport in die Außensegmente sowie die regulierte Deaktivierung von GPCRs. Eine Fehlregulation oder Mutation von RHO ist mit erblichen retinalen Degenerationen assoziiert, was es zu einem wichtigen Ziel für mechanistische Studien zur GPCR-Signalübertragung, zu Stressantworten von Photorezeptoren und zur Genregulation in retinalen Modellen macht.

rhodopsin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen RHO-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

rhodopsin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des RHO-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der RHO-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen rhodopsin-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native RHO-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von rhodopsin-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des rhodopsin-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem RHO-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.