rhodopsin Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401026-ACT

Il gene umano RHO codifica la rodopsina, un recettore accoppiato a proteine G sensibile alla luce incorporato nei dischi del segmento esterno dei fotorecettori a bastoncelli, che avvia la cascata della fototrasduzione. In seguito all’assorbimento di un fotone, la rodopsina attiva la transducina modulando la segnalazione del cGMP, controllando l’attività dei canali regolati da nucleotidi ciclici e la successiva iperpolarizzazione di membrana, fondamentale per la visione in condizioni di scarsa illuminazione. L’espressione di RHO e il turnover della proteina sono strettamente collegati ai processi di omeostasi retinica, inclusi la rigenerazione del cromoforo nel ciclo visivo, il trafficking verso i segmenti esterni e la disattivazione regolata dei GPCR. La deregolazione o le mutazioni di RHO sono associate a degenerazioni retiniche ereditarie, rendendolo un bersaglio chiave per studi meccanicistici sulla segnalazione dei GPCR, sulle risposte allo stress dei fotorecettori e sulla regolazione genica in modelli retinici.

rhodopsin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di RHO senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

rhodopsin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus RHO nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione RHO, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di rhodopsin. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus RHO nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da rhodopsin nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via rhodopsin nelle cellule tumorali con espressione di RHO silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.