RFX6 Particelle di Attivazione Lentivirale (h2): sc-408496-LAC-2

L’RFX6 umano (regulatory factor X6) codifica un fattore di trascrizione winged-helix che si lega ai motivi di DNA X-box per controllare programmi genici necessari alla specificazione della linea endocrina pancreatica e alla maturazione e al mantenimento delle cellule β produttrici di insulina. Agisce all’interno di reti trascrizionali che regolano lo sviluppo delle isole pancreatiche, la secrezione ormonale stimolata dal glucosio e vie più ampie di regolazione genica che coordinano le decisioni di destino cellulare delle cellule derivate dall’endoderma. Alterazioni genetiche o un’espressione deregolata di RFX6 sono state associate a difetti congeniti del pancreas endocrino e a forme di diabete, rendendolo un nodo chiave per lo studio dei meccanismi del diabete monogenico e della disfunzione delle cellule delle isole. L’editing genetico di RFX6 consente l’analisi meccanicistica della regolazione enhancer–promoter, dell’occupazione della cromatina e dei circuiti genici endocrini a valle in modelli di differenziamento di cellule staminali umane e in sistemi rilevanti per le isole pancreatiche.

Le particelle di attivazione lentivirale RFX6 (h2) rispondono a questa esigenza incapsulando il sistema completo di attivazione trascrizionale del mediatore di attivazione sinergica (SAM) in particelle lentivirali ad alto titolo pronte per la trasduzione, consentendo un'efficiente sovraregolazione di RFX6 in una gamma più ampia di tipi di cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale RFX6 (h2) veicolano tutti i componenti funzionali del sistema del mediatore di attivazione sinergica (SAM) tramite trasduzione lentivirale. Il sistema comprende tre preparati di particelle co-trasdotti nelle cellule bersaglio: uno che codifica per dCas9 cataliticamente inattivo (mutazioni D10A e N863A) fuso al dominio di transattivazione VP64 con un gene di resistenza alla blasticidina; una che codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 con un gene di resistenza all'igromicina; e una che codifica un sgRNA di 20 nt specifico per il bersaglio fuso a due aptameri di RNA MS2 con un gene di resistenza alla puromicina. A seguito della trasduzione lentivirale e dell'integrazione genomica dei cassetti di espressione, i componenti del SAM vengono espressi in modo stabile e si assemblano nel locus bersaglio all'interno della regione promotrice prossimale a monte del sito di inizio della trascrizione RFX6, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo cooperativo per reclutare il machinery trascrizionale endogeno e guidare una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endogena di RFX6. L'uso di dCas9 inattivo nei confronti delle nucleasi evita l'introduzione di rotture del DNA a doppio filamento e preserva il locus genomico nativo RFX6 e l'architettura regolatoria.

Il formato lentivirale offre diversi vantaggi pratici: l'integrazione genomica stabile supporta l'attivazione ereditaria attraverso le divisioni cellulari; le preparazioni di particelle ad alto titolo eliminano la necessità di una produzione virale interna; e la compatibilità con tipi di cellule primarie, non in divisione e resistenti alla trasfezione amplia l'accessibilità sperimentale. Il successo della trasduzione può essere confermato e potenziato attraverso una selezione antibiotica tripla utilizzando puromicina, igromicina e blasticidina.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.