Ret Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400311-ACT

RET codifica Ret, una tirosin-chinasi recettoriale attivata dai ligandi della famiglia GDNF tramite i co-recettori GFRα, che regola la sopravvivenza, la differenziazione e la migrazione cellulare. La segnalazione di Ret si propaga attraverso le vie MAPK/ERK, PI3K/AKT, PLCγ e RAS, modellando programmi di sviluppo nelle linee cellulari derivate dalla cresta neurale e nella morfogenesi renale. Un’espressione o un’attività di RET deregolate sono implicate in reti di segnalazione oncogeniche e in fenotipi neurosviluppativi, rendendolo un nodo ampiamente utilizzato per studiare il cross-talk tra tirosin-chinasi recettoriali, la specificazione di linea e le risposte trascrizionali dipendenti dal segnale.

Ret Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di RET senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Ret Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus RET nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione RET, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Ret. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus RET nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Ret nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Ret nelle cellule tumorali con espressione di RET silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.