Plásmido CRISPR de Activación (h) REP-1: sc-404025-ACT

CHM codifica la proteína escolta de Rab 1 (REP-1), una chaperona citosólica esencial para la geranilgeranilación postraduccional de las GTPasas Rab, al presentar las proteínas Rab nacientes a la Rab geranilgeraniltransferasa (GGTasa II). Esta modificación es necesaria para la asociación de Rab con membranas y regula el tráfico vesicular, la dinámica endosoma–lisosoma y la secreción regulada en múltiples tipos celulares, incluido el epitelio pigmentario de la retina. La alteración de la función de REP-1 perturba la prenilación de Rab y el transporte intracelular, procesos estrechamente vinculados a la homeostasis de los fotorreceptores y del EPR. La deficiencia de CHM se asocia con la coroideremia, lo que convierte a REP-1 en un punto relevante para estudios mecanísticos del estrés del tráfico de membranas y de fenotipos celulares asociados a la degeneración.

REP-1 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de CHM sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

REP-1 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus CHM en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional CHM, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de REP-1. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo CHM y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de REP-1 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía REP-1 en células tumorales con expresión de CHM silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.