Ras-GRF2 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404141-ACT

O RASGRF2 humano codifica a Ras-GRF2, um fator de troca de nucleotídeos de guanina regulado por cálcio e diacilglicerol que ativa a RAS e pode modular a sinalização de RAC, acoplando estímulos extracelulares à dinâmica intracelular da cascata MAPK/ERK. A Ras-GRF2 integra entradas de receptores tirosina-quinase e de vias associadas a GPCR para influenciar proliferação, diferenciação, remodelamento do citoesqueleto e sinalização relacionada à plasticidade neuronal. No sistema nervoso, contribui para a sinalização dependente da atividade e para a função sináptica, enquanto em outros contextos celulares pode remodelar programas transcricionais induzidos por fatores de crescimento por meio de efetores dependentes de ERK. A desregulação da sinalização da via RAS é amplamente relevante para fenótipos oncogênicos e do neurodesenvolvimento, tornando o RASGRF2 um nó útil para dissecar a ativação de RAS e o controle por feedback específicos de cada contexto.

Ras-GRF2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de RASGRF2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Ras-GRF2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus RASGRF2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição RASGRF2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Ras-GRF2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus RASGRF2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Ras-GRF2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Ras-GRF2 em células tumorais com expressão de RASGRF2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.