RANK CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400559-ACT

TNFRSF11A kodiert RANK, ein Mitglied der TNF-Rezeptor-Superfamilie, das als zentraler Signalknoten in der RANKL-gesteuerten Kontrolle der Osteoklastendifferenzierung, -aktivierung und des Überlebens fungiert. Nach Ligandenbindung rekrutiert RANK Adapterproteine wie TRAFs, um kanonische und nichtkanonische NF-κB-Signalwege, MAPK-Kaskaden sowie AP-1-/NFATc1-abhängige Transkriptionsprogramme zu initiieren. Diese Signalwege integrieren Hinweise aus dem Knochenmikromilieu und dem Immunsystem, wodurch die RANK-Aktivität mit der Osteoimmunologie und der Regulation der Expression entzündungsrelevanter Gene verknüpft wird. Eine fehlregulierte RANK-Signalgebung wurde mit abnormen Phänotypen des Knochenumbaus und veränderter Funktion von Immunzellen in Verbindung gebracht, weshalb TNFRSF11A ein häufig verwendetes Ziel für mechanistische Studien der Skelett- und Entzündungsbiologie ist.

RANK Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TNFRSF11A-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

RANK Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TNFRSF11A-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TNFRSF11A-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen RANK-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TNFRSF11A-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von RANK-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des RANK-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TNFRSF11A-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.