RAG-1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401821-ACT

RAG1 codifica RAG-1, un’endonucleasi specifica delle cellule linfoidi essenziale per avviare la ricombinazione V(D)J durante lo sviluppo dei linfociti B e T, introducendo rotture a doppio filamento del DNA sito-specifiche a livello delle sequenze segnale di ricombinazione. Questa attività collega la diversificazione dei recettori dell’antigene alle vie di risposta e riparazione del danno al DNA, in particolare la giunzione delle estremità non omologhe (NHEJ), per garantire l’assemblaggio produttivo dei loci delle immunoglobuline e del recettore dei linfociti T. Una funzione di RAG-1 disregolata o compromessa è associata a una maturazione difettosa dei linfociti e a instabilità genomica, collegando la biologia di RAG1 a fenotipi di immunodeficienza primaria e a riarrangiamenti cromosomici aberranti. In quanto “guardiano” della formazione del repertorio immunitario adattativo, RAG-1 è ampiamente studiato nei meccanismi di taglio programmato del DNA, accessibilità della cromatina e differenziamento delle cellule immunitarie.

RAG-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di RAG1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

RAG-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus RAG1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione RAG1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di RAG-1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus RAG1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da RAG-1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via RAG-1 nelle cellule tumorali con espressione di RAG1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.