Partículas Lentivirales de Activación (h) Raf-1: sc-400202-LAC

El RAF1 humano codifica Raf-1, una cinasa de serina/treonina que funciona como un nodo central de la vía MAPK, enlazando las GTPasas activadas de la familia RAS con la señalización de MEK1/2 y ERK1/2. Raf-1 integra señales de receptores tirosina cinasa y de diversas proteínas de andamiaje para regular la proliferación, la diferenciación, la supervivencia y las respuestas al estrés, con funciones adicionales en la dinámica del citoesqueleto y la señalización mitocondrial. La actividad desregulada de RAF1 contribuye a la salida aberrante de ERK observada en múltiples contextos de señalización relacionados con el cáncer, y también se implica en fenotipos de rasopatías mediante la hiperactivación de la vía y la alteración de la señalización del desarrollo. Por ello, RAF1 sirve como punto de entrada mecanístico para estudiar la retroalimentación de la vía, el control de la amplitud y la duración de la señal, y el diálogo cruzado con PI3K/AKT y reguladores apoptóticos.

Las partículas de activación lentiviral Raf-1 (h) responden a esta necesidad al empaquetar el sistema completo de activación transcripcional del mediador de activación sinérgica (SAM) en partículas lentivirales de alto título listas para la transducción, lo que permite una regulación al alza eficiente de RAF1 en una gama más amplia de tipos de células humanas.

Las partículas de activación lentiviral Raf-1 (h) suministran todos los componentes funcionales del sistema mediador de activación sinérgica (SAM) a través de la transducción lentiviral. El sistema comprende tres preparaciones de partículas cotransducidas en las células diana: una que codifica dCas9 catalíticamente inactivo (mutaciones D10A y N863A) fusionado al dominio de transactivación VP64 con un gen de resistencia a la blasticidina; otra que codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1 con un gen de resistencia a la higromicina; y otra que codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 con un gen de resistencia a la puromicina. Tras la transducción lentiviral y la integración genómica de los casetes de expresión, los componentes del SAM se expresan de forma estable y se ensamblan en el locus diana dentro de la región promotora proximal, aguas arriba del sitio de inicio de la transcripción RAF1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma cooperativa para reclutar la maquinaria transcripcional endógena e impulsar la regulación al alza sostenida de la expresión endógena de Raf-1. El uso de dCas9 inactivo frente a nucleasas evita la introducción de roturas de ADN de doble cadena y preserva el locus genómico nativo RAF1 y la arquitectura reguladora.

El formato lentiviral ofrece varias ventajas prácticas: la integración genómica estable permite la activación hereditaria a lo largo de las divisiones celulares; las preparaciones de partículas de alto título eliminan la necesidad de producir el virus internamente; y la compatibilidad con tipos de células primarias, no divisibles y resistentes a la transfección amplía la accesibilidad experimental. La transducción exitosa puede confirmarse y enriquecerse mediante selección con triple antibiótico utilizando puromicina, higromicina y blasticidina.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.