PSA/KLK3/Kallikrein 3/Prostate Specific Antigen Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400448-ACT

KLK3 codifica l’antigene prostatico specifico (PSA), una serin-proteasi secreta correlata alle callicreine che partecipa al processamento proteolitico delle proteine del plasma seminale e alla regolazione delle cascate extracellulari di proteasi. L’espressione di PSA/KLK3 è fortemente regolata dalla segnalazione mediata dal recettore degli androgeni ed è strettamente associata alla differenziazione dell’epitelio prostatico e all’identità delle cellule luminali. In quanto componente del rimodellamento tissutale e della proteolisi in prossimità della matrice extracellulare, l’attività di KLK3 interseca vie che governano la secrezione, l’equilibrio tra attivazione/inibizione delle proteasi e le dinamiche del microambiente. La trascrizione deregolata di KLK3 è ampiamente utilizzata come indicatore molecolare dei programmi responsivi agli androgeni e della fisiopatologia prostatica nei modelli sperimentali.

PSA/KLK3/Kallikrein 3/Prostate Specific Antigen Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di KLK3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PSA/KLK3/Kallikrein 3/Prostate Specific Antigen Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus KLK3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione KLK3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PSA/KLK3/Kallikrein 3/Prostate Specific Antigen. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus KLK3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PSA/KLK3/Kallikrein 3/Prostate Specific Antigen nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PSA/KLK3/Kallikrein 3/Prostate Specific Antigen nelle cellule tumorali con espressione di KLK3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.