Prothrombin Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400962-ACT

F2 codifica la protrombina, uno zimogeno vitamina K–dipendente che viene convertito per via proteolitica in trombina, una serin-proteasi centrale nella cascata della coagulazione. La trombina scinde il fibrinogeno in fibrina, amplifica la coagulazione tramite l’attivazione dei fattori V, VIII, XI e XIII e collega l’emostasi alle risposte cellulari attraverso la segnalazione mediata dai recettori attivati da proteasi (PAR) nelle piastrine e nelle cellule vascolari. La regolazione dell’attivazione della protrombina interseca le vie anticoagulanti, incluse l’antitrombina e il sistema della proteina C, modellando la cinetica di generazione della trombina e la stabilità del coagulo. Un’espressione o un’attività di F2 deregolata è associata a squilibri della coagulazione e a fenotipi trombotici, sostenendone l’utilizzo come nodo meccanicistico per lo studio dell’emostasi e della biologia vascolare associata all’infiammazione.

Prothrombin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di F2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Prothrombin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus F2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione F2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Prothrombin. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus F2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Prothrombin nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Prothrombin nelle cellule tumorali con espressione di F2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.