Prothrombin Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400962-ACT

O F2 codifica a protrombina, um zimogénio dependente de vitamina K que é convertido por proteólise em trombina, uma serina protease central na cascata de coagulação. A trombina cliva o fibrinogénio em fibrina, amplifica a coagulação através da ativação dos fatores V, VIII, XI e XIII e liga a hemostase a respostas celulares por meio da sinalização de recetores ativados por protease (PAR) em plaquetas e células vasculares. A regulação da ativação da protrombina cruza-se com vias anticoagulantes, incluindo a antitrombina e o sistema da proteína C, moldando a cinética de geração de trombina e a estabilidade do coágulo. A desregulação da expressão ou atividade de F2 está associada a desequilíbrio da coagulação e fenótipos trombóticos, sustentando o seu uso como um nó mecanístico para estudar a hemostase e a biologia vascular associada à inflamação.

Prothrombin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de F2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Prothrombin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus F2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição F2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Prothrombin. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus F2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Prothrombin no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Prothrombin em células tumorais com expressão de F2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.