Profilin-1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402070-ACT

PFN1 kodiert Profilin-1, ein konserviertes aktinbindendes Protein, das die Verfügbarkeit von Aktinmonomeren reguliert und eine kontrollierte Aktinpolymerisation fördert. Dadurch prägt es die Zytoskelettdynamik, Membranruffling und die Zellmotilität. Profilin-1 interagiert mit prolinreichen Liganden und der Phosphoinositid-Signalübertragung und verbindet so den Aktinumbau mit Signalwegen, die Endozytose, Adhäsion und Mechanotransduktion steuern. Aufgrund seiner zentralen Rolle in der Organisation des Zytoskeletts wird PFN1 häufig im Zusammenhang mit neuronaler Integrität, Migration und Stressantworten untersucht. Eine veränderte PFN1-Expression oder -Funktion wurde mit fehlregulierter Aktindynamik in zellulären Phänotypen in Verbindung gebracht, wie sie bei Neurodegeneration und Krebs auftreten, was PFN1 zu einem nützlichen Ziel für pfadfokussierte Untersuchungen macht.

Profilin-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PFN1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Profilin-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PFN1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PFN1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Profilin-1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PFN1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Profilin-1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Profilin-1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PFN1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.