POLR3GL Particelle di Attivazione Lentivirale (h): sc-413599-LAC

POLR3GL codifica una subunità centrale dell’RNA polimerasi III che contribuisce alla trascrizione di piccoli RNA non codificanti, tra cui tRNA, rRNA 5S e altri trascritti dipendenti dalla Pol III essenziali per la capacità di sintesi proteica e per l’omeostasi cellulare. Attraverso la regolazione dell’output della Pol III, POLR3GL influenza programmi legati alla crescita, risposte allo stress cellulare e vie di rilevamento dell’immunità innata associate a specie di RNA citosolico. Alterazioni della funzione della Pol III e una biogenesi deregolata dei piccoli RNA sono state associate a fenotipi del neurosviluppo e a meccanismi più ampi rilevanti per il controllo trascrizionale in tessuti proliferativi e metabolicamente attivi. POLR3GL rappresenta quindi un nodo utile per indagare la regolazione trascrizionale della Pol III, il metabolismo dell’RNA e gli effetti a valle sulle transizioni dello stato cellulare.

Le particelle di attivazione lentivirale POLR3GL (h) rispondono a questa esigenza incapsulando il sistema completo di attivazione trascrizionale del mediatore di attivazione sinergica (SAM) in particelle lentivirali ad alto titolo pronte per la trasduzione, consentendo un'efficiente sovraregolazione di POLR3GL in una gamma più ampia di tipi di cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale POLR3GL (h) veicolano tutti i componenti funzionali del sistema del mediatore di attivazione sinergica (SAM) tramite trasduzione lentivirale. Il sistema comprende tre preparati di particelle co-trasdotti nelle cellule bersaglio: uno che codifica per dCas9 cataliticamente inattivo (mutazioni D10A e N863A) fuso al dominio di transattivazione VP64 con un gene di resistenza alla blasticidina; una che codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 con un gene di resistenza all'igromicina; e una che codifica un sgRNA di 20 nt specifico per il bersaglio fuso a due aptameri di RNA MS2 con un gene di resistenza alla puromicina. A seguito della trasduzione lentivirale e dell'integrazione genomica dei cassetti di espressione, i componenti del SAM vengono espressi in modo stabile e si assemblano nel locus bersaglio all'interno della regione promotrice prossimale a monte del sito di inizio della trascrizione POLR3GL, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo cooperativo per reclutare il machinery trascrizionale endogeno e guidare una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endogena di POLR3GL. L'uso di dCas9 inattivo nei confronti delle nucleasi evita l'introduzione di rotture del DNA a doppio filamento e preserva il locus genomico nativo POLR3GL e l'architettura regolatoria.

Il formato lentivirale offre diversi vantaggi pratici: l'integrazione genomica stabile supporta l'attivazione ereditaria attraverso le divisioni cellulari; le preparazioni di particelle ad alto titolo eliminano la necessità di una produzione virale interna; e la compatibilità con tipi di cellule primarie, non in divisione e resistenti alla trasfezione amplia l'accessibilità sperimentale. Il successo della trasduzione può essere confermato e potenziato attraverso una selezione antibiotica tripla utilizzando puromicina, igromicina e blasticidina.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.