Pol II Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400053-ACT

POLR2A codifica la subunità più grande della RNA polimerasi II (Pol II) umana, l’enzima centrale che sintetizza l’mRNA e molti RNA non codificanti e che integra la pausa prossimale al promotore, l’elongazione e la maturazione co-trascrizionale dell’RNA. La funzione di Pol II è coordinata lungo il ciclo trascrizionale tramite la fosforilazione del dominio C-terminale, accoppiando la trascrizione allo splicing, al cappuccio 5′ e alla formazione dell’estremità 3′, e collegando i programmi di espressione genica alla regolazione della cromatina e alle risposte al danno del DNA. In quanto nodo centrale del controllo trascrizionale, POLR2A è spesso utilizzato come riferimento per l’output trascrizionale globale e per l’adattamento allo stress cellulare. Alterazioni dell’attività di Pol II e la disregolazione trascrizionale sono ampiamente associate a stati trascrizionali oncogenici e a fenotipi neurosviluppativi, rendendo POLR2A rilevante per studi meccanicistici della regolazione genica.

Pol II Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di POLR2A senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Pol II Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus POLR2A nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione POLR2A, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Pol II. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus POLR2A nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Pol II nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Pol II nelle cellule tumorali con espressione di POLR2A silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.