Plásmido CRISPR de Activación (h) Pol II: sc-400053-ACT

POLR2A codifica la subunidad más grande de la ARN polimerasa II (Pol II) humana, la enzima central que sintetiza ARNm y muchos ARN no codificantes e integra la pausa proximal al promotor, la elongación y el procesamiento co-transcripcional del ARN. La función de Pol II se coordina a lo largo del ciclo de transcripción mediante la fosforilación del dominio C-terminal, acoplando la transcripción al empalme (splicing), al caperuzado 5′ y a la formación del extremo 3′, y vinculando los programas de expresión génica con la regulación de la cromatina y las respuestas al daño del ADN. Como nodo central del control transcripcional, POLR2A se utiliza con frecuencia como referencia de la producción transcripcional global y de la adaptación celular al estrés. La actividad alterada de Pol II y la desregulación de la transcripción se asocian ampliamente con estados transcripcionales oncogénicos y fenotipos del neurodesarrollo, lo que hace que POLR2A sea relevante para estudios mecanísticos de la regulación génica.

Pol II El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de POLR2A sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Pol II El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus POLR2A en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional POLR2A, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Pol II. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo POLR2A y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Pol II en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Pol II en células tumorales con expresión de POLR2A silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.