PME-1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402446-ACT

O PPME1 humano codifica a metilesterase de fosfatase proteica 1 (PME-1), uma enzima que hidrolisa o éster metílico C-terminal das subunidades catalíticas da PP2A e, assim, modula a montagem, a localização e a seleção de substratos do holoenzima PP2A. Ao regular o estado de metilação da PP2A, a PME-1 influencia o controle dependente de fosforilação da progressão do ciclo celular, da sinalização de dano ao DNA e de vias responsivas ao estresse, incluindo os desfechos das redes MAPK e PI3K/AKT. A regulação alterada da PP2A é amplamente relevante para mecanismos de sinalização aberrante de quinases e de proteostase, frequentemente estudados na biologia do câncer e na neurodegeneração. Assim, o PPME1 é um nó útil para dissecar como o ajuste fino de fosfatases remodela a dinâmica de sinalização e os fenótipos celulares em condições fisiológicas e associadas a doenças.

PME-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de PPME1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

PME-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus PPME1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição PPME1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de PME-1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus PPME1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de PME-1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via PME-1 em células tumorais com expressão de PPME1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.