plexin-B1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401840-ACT

PLXNB1 codifica la plexina-B1, un recettore transmembrana per le semaforine di classe 4 che coordina la segnalazione dipendente dal contatto per regolare il rimodellamento del citoscheletro, la migrazione cellulare direzionale e la guida assonale. La plexina-B1 integra segnali attraverso le GTPasi della famiglia Rho e i relativi effettori, influenzando la dinamica dell’actina, il turnover delle adesioni e i programmi di polarità cellulare, con effetti a valle sul patterning tissutale e sull’organizzazione delle barriere. Nella biologia umana, alterazioni dell’espressione o della segnalazione di PLXNB1 sono state collegate a una motilità disregolata e a un comportamento invasivo in modelli di cancro, nonché a processi di neurosviluppo in cui le vie semaforina–plexina modellano la connettività neuronale. Queste caratteristiche rendono la plexina-B1 un nodo utile per studiare la segnalazione delle semaforine, il rimodellamento legato a Rho/ROCK e i cambiamenti dipendenti dal contesto nelle interazioni cellula–cellula e cellula–matrice.

plexin-B1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PLXNB1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

plexin-B1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PLXNB1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PLXNB1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di plexin-B1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PLXNB1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da plexin-B1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via plexin-B1 nelle cellule tumorali con espressione di PLXNB1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.