Plásmido CRISPR de Activación (m) PISD: sc-435844-ACT

La PISD (descarboxilasa de fosfatidilserina) del ratón es una enzima de la membrana interna mitocondrial que cataliza la conversión de fosfatidilserina en fosfatidiletanolamina, un paso clave en la remodelación de fosfolípidos necesaria para la biogénesis de membranas y la dinámica de los orgánulos. Al modular la disponibilidad de fosfatidiletanolamina, PISD contribuye a la morfología mitocondrial, al rendimiento de la fosforilación oxidativa y a procesos vinculados a la señalización dependiente de lípidos y a la autofagia. La alteración de la homeostasis lipídica asociada a PISD es relevante para estudios de respuestas al estrés mitocondrial y de adaptación metabólica, y se ha relacionado con fenotipos del neurodesarrollo y neuromusculares en contextos de enfermedades genéticas. En consecuencia, Pisd se investiga con frecuencia en vías que regulan la función mitocondrial, el tráfico de membranas y la aptitud celular impulsada por el metabolismo de lípidos.

PISD El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Pisd sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

PISD El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Pisd en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Pisd, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de PISD. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Pisd y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de PISD en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía PISD en células tumorales con expresión de Pisd silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.