PI-9 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-423120-ACT

Serpinb9 murino codifica PI-9, un inibitore intracellulare delle serin-proteasi che limita l’attività della granzima B per modulare la funzione effettrice dei linfociti citotossici e prevenire l’apoptosi mediata da proteasi nelle cellule presentanti l’antigene e nelle cellule a privilegio immunitario. Attenuando gli eventi di clivaggio mediati dalla granzima B, PI-9 contribuisce alla regolazione dell’attivazione delle caspasi, della sopravvivenza delle cellule infiammatorie e dell’omeostasi immunitaria durante le interazioni citotossiche cellula-cellula. L’espressione di Serpinb9 è associata a meccanismi di evasione immunitaria e persistenza in microambienti infiammatori, rendendola rilevante per studi di immunobiologia tumorale, autoimmunità e biologia dei trapianti. La sua regolazione inducibile è inoltre collegata a programmi trascrizionali responsivi a stress e citochine che influenzano la differenziazione delle cellule immunitarie e la tolleranza immunitaria specifica di tessuto.

PI-9 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Serpinb9 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PI-9 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Serpinb9 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Serpinb9, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PI-9. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Serpinb9 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PI-9 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PI-9 nelle cellule tumorali con espressione di Serpinb9 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.