PGK1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401288-ACT

Das humane PGK1-Gen kodiert die Phosphoglyceratkinase 1, ein zentrales Enzym der Glykolyse, das die ATP-bildende Umwandlung von 1,3-Bisphosphoglycerat zu 3-Phosphoglycerat katalysiert. Aufgrund seiner Schlüsselposition im Glukosestoffwechsel beeinflusst PGK1 die zelluläre Bioenergetik, das Redoxgleichgewicht und die metabolische Anpassung unter Hypoxie und ist dabei in Signal- und Stoffwechselwege wie Glykolyse/Gluconeogenese sowie HIF-regulierte Transkriptionsprogramme eingebunden. Veränderungen der PGK1-Expression und -Aktivität werden mit metabolischer Reprogrammierung in proliferativen Zuständen sowie mit der erblichen PGK1-Defizienz in Verbindung gebracht, die Gewebe mit hohem Energiebedarf beeinträchtigen kann. Als häufig verwendeter konstitutiver Expressionslokus in der Molekularbiologie und als Knotenpunkt des Energiestoffwechsels ist PGK1 ein nützliches Ziel zur Untersuchung von Stoffwechselfluss und Genregulation.

PGK1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PGK1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PGK1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PGK1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PGK1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PGK1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PGK1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PGK1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PGK1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PGK1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.