Per3 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-411220-ACT

Il gene umano **PER3** codifica per il componente dell’orologio circadiano **Per3**, un regolatore contenente un dominio PAS che contribuisce a coordinare i circuiti di retroazione trascrizionale–traduzionale che controllano i ritmi delle 24 ore. PER3 interagisce con il nucleo del macchinario dell’orologio (inclusi i complessi PER/CRY e la trascrizione guidata da CLOCK:BMAL1) per modulare programmi di espressione genica ritmica che influenzano la tempistica del ciclo cellulare, il metabolismo, la segnalazione ormonale e la fisiologia neuronale. Alterazioni della funzione o dell’espressione di PER3 sono associate a fenotipi di disallineamento circadiano, come variazioni nella tempistica sonno–veglia, e sono state studiate in contesti in cui la perturbazione dell’orologio correla con tratti neuropsichiatrici e rischio cardiometabolico. PER3 rappresenta quindi un bersaglio utile per analizzare la regolazione delle vie circadiane, i meccanismi di ripristino di fase e i trascrittomi oscillatori a valle in modelli cellulari umani.

Per3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PER3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Per3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PER3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PER3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Per3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PER3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Per3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Per3 nelle cellule tumorali con espressione di PER3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.