PDLIM5 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-405340-ACT

PDLIM5 codifica una proteina impalcatura contenente domini PDZ e LIM, localizzata in strutture associate all’actina, che collega l’organizzazione del citoscheletro alla trasduzione del segnale. Nelle cellule umane, PDLIM5 partecipa alla regolazione della dinamica dell’actina, dell’adesione cellulare e delle vie meccanosensibili coordinando interazioni proteina‑proteina lungo le fibre di stress e in assemblaggi simili al disco Z. Attraverso queste funzioni, influenza processi quali morfologia cellulare, migrazione e contrattilità, e si integra con reti di segnalazione chinasi che rispondono a segnali provenienti dal citoscheletro. Alterazioni dell’espressione di PDLIM5 e dell’attività delle relative vie sono state studiate nel contesto della biologia di malattie cardiovascolari e neuropsichiatriche, supportandone l’utilità come nodo per investigare i meccanismi di segnalazione accoppiati al citoscheletro.

PDLIM5 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PDLIM5 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PDLIM5 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PDLIM5 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PDLIM5, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PDLIM5. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PDLIM5 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PDLIM5 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PDLIM5 nelle cellule tumorali con espressione di PDLIM5 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.