PDGF-D Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402406-ACT

PDGFD codifica il platelet-derived growth factor D (PDGF-D), un fattore di crescita secreto che segnala principalmente attraverso PDGFRβ per regolare la proliferazione e la migrazione delle cellule mesenchimali, nonché il rimodellamento della matrice extracellulare. L’attivazione dell’asse PDGF-D–PDGFR coinvolge a valle le vie MAPK/ERK, PI3K/AKT e STAT, che coordinano processi legati all’angiogenesi e il crosstalk tra stroma ed epitelio. Un’espressione deregolata di PDGFD è stata associata ad alterazioni dell’attivazione dei fibroblasti, al rimodellamento vascolare e a fenotipi invasivi in diversi contesti rilevanti per la malattia, rendendolo un nodo utile per studiare la segnalazione paracrina in microambienti complessi. Modelli in vitro e in vivo che sfruttano la perturbazione di PDGF-D sono comunemente utilizzati per analizzare cambiamenti, guidati dai fattori di crescita, nella motilità cellulare, nella sopravvivenza e nella deposizione di matrice.

PDGF-D Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PDGFD senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PDGF-D Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PDGFD nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PDGFD, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PDGF-D. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PDGFD nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PDGF-D nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PDGF-D nelle cellule tumorali con espressione di PDGFD silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.