Plásmido CRISPR de Activación (h) PD-ECGF: sc-403836-ACT

TYMP codifica la timidina fosforilasa, también conocida como factor de crecimiento endotelial derivado de plaquetas (PD-ECGF), una enzima citosólica que cataliza la fosforólisis de timidina y desoxiuridina para regular las reservas de nucleósidos y el rescate de nucleótidos. A través de su impacto en el metabolismo de las pirimidinas, TYMP influye en las respuestas al estrés de replicación del ADN, el equilibrio de nucleótidos mitocondriales y una homeostasis redox y metabólica celular más amplia. La actividad de PD-ECGF se ha relacionado con la biología endotelial y la remodelación tisular mediante efectos de señalización impulsados por metabolitos, conectando el metabolismo de nucleósidos con programas angiogénicos. La expresión o función desregulada de TYMP se asocia con alteraciones del metabolismo de nucleótidos observadas en trastornos proliferativos y mitocondriales, lo que respalda su uso como diana para estudios mecanísticos en modelos de enfermedad asociados al metabolismo.

PD-ECGF El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de TYMP sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

PD-ECGF El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus TYMP en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional TYMP, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de PD-ECGF. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo TYMP y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de PD-ECGF en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía PD-ECGF en células tumorales con expresión de TYMP silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.