PAI-1/SERPINE1 Plasmide di attivazione CRISPR (m2): sc-422287-ACT-2

Nel topo, Serpine1 codifica l’inibitore dell’attivatore del plasminogeno di tipo 1 (PAI-1), una serpin secreta che inibisce gli attivatori del plasminogeno di tipo tissutale e di tipo urochinasi (tPA/uPA) per limitare la generazione di plasmina e quindi regolare la fibrinolisi, la proteolisi pericellulare e il rimodellamento della matrice extracellulare. PAI-1 integra segnali provenienti dal TGF-β, dalle citochine infiammatorie e dalle vie dello stress ossidativo per influenzare l’adesione e la migrazione cellulare e la riparazione tissutale, con effetti a valle sulla guarigione delle ferite e sul rimodellamento fibrotico. Un’espressione deregolata di Serpine1/PAI-1 è associata a fenotipi trombotici ed emorragici, a infiammazione metabolica legata all’obesità e a fibrosi d’organo, rendendolo un bersaglio rilevante per studi meccanicistici su emostasi, biologia vascolare e patologie infiammatorie croniche. L’editing genetico o la perturbazione di Serpine1 in modelli murini consente l’analisi funzionale dell’equilibrio proteasi–antiproteasi, del turnover della matrice e delle reti di segnalazione che collegano l’infiammazione al rimodellamento in vivo e in saggi basati su cellule.

PAI-1/SERPINE1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m2) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Serpine1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PAI-1/SERPINE1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m2) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Serpine1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Serpine1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PAI-1/SERPINE1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Serpine1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PAI-1/SERPINE1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PAI-1/SERPINE1 nelle cellule tumorali con espressione di Serpine1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.