PAI-1/SERPINE1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400300-ACT

SERPINE1 codifica l’inibitore dell’attivatore del plasminogeno-1 (PAI-1), una serpin secreta che inibisce gli attivatori del plasminogeno di tipo tissutale e di tipo urochinasi, limitando la generazione di plasmina e la fibrinolisi. Controllando la proteolisi pericellulare, PAI-1 influenza il turnover della matrice extracellulare, l’adesione e la migrazione cellulare, e programmi di rimodellamento tissutale che intersecano la segnalazione del TGF-β e segnali infiammatori. L’espressione di SERPINE1 è regolata dinamicamente nella senescenza e nelle risposte allo stress associate all’ipossia, modulando l’equilibrio delle proteasi nei microambienti vascolari e stromali. Un’attività deregolata di PAI-1 è stata associata a fenotipi trombotici e fibrotici e a processi di rimodellamento associati ai tumori, a supporto di studi meccanicistici sulla proteostasi e sulla biologia della matrice.

PAI-1/SERPINE1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SERPINE1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PAI-1/SERPINE1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SERPINE1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SERPINE1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PAI-1/SERPINE1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SERPINE1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PAI-1/SERPINE1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PAI-1/SERPINE1 nelle cellule tumorali con espressione di SERPINE1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.